產品FAQ

質粒DNA純化常見問題解答

Q:產量低

A:

? 檢查細胞生長情況,培養條件是否適合質粒增殖。盡可能選擇高拷貝數的質粒。

? 如果質粒拷貝數低,可適當增加收集的菌液量,但是要保證菌體可以被完全裂解。

? 如果裂解液過于粘稠,應適當減少菌體量。

? 培養時間過長或在 2-8℃保存時間過長會明顯降低產量,建議使用新鮮的菌液。


Q:質粒 DNA 中有基因組 DNA 污染

A:裂解時間不宜超過 5 分鐘。


Q:影響下游酶切

A:洗滌液 WB 洗滌后應盡量離心去除殘留的液體,待硅膠膜完全干燥后再加入洗脫緩沖液。


基因組DNA純化常見問題解答

Q:DNA 產量低

A:

? 裂解不充分:減少起始材料的用量。檢查樣品中是否加入了 Proteinase K溶液。如果提取的材料為動物組織,盡量將組織切碎,并要保證材料完全浸泡在裂解液中。適當延長裂解時間。

? 提取材料質量不好:盡量選用新鮮材料,樣品采集后應盡快保存在 -70℃或液氮中。DNA 的產量取決于材料的種類和幼嫩程度。

? 離心柱堵塞:過柱前檢查裂解液是否清亮,去除溶液中過于粘稠的不溶物。

? 洗滌溶液中未添加無水乙醇。必須在洗滌溶液中添加合適比例的無水乙醇。

? 洗脫條件不合適:洗脫液 EB 或超純水最好預先加熱至 70℃,用超純水洗脫前應檢查其pH 值是否在 7.0-8.5 之間,如 pH 值小于 7 將明顯影響洗脫效率,需調節后再進行洗脫。洗脫液應盡量加到離心柱的中央,在離心前室溫靜置 1 分鐘。

? DNA 斷裂或降解:避免因移液槍反復吹吸或反復凍融樣品造成的 DNA 損傷。避免在操作過程中帶入外源 DNase 污染。


Q:洗脫液顏色發黑或硅膠膜脫色 ( 動物組織或鼠尾材料 )

A:來源于組織的色素大量結合在離心柱上并與 DNA 一并洗脫:在過柱前檢查是否已加入乙醇,乙醇可防止色素與硅膠膜結合。在裂解液結合步驟可適當加大轉速和延長離心時間。

? RNA 污染:可在樣品材料制備過程中添加適量的 RNase A 降解 RNA。


Q:影響下游的酶切

A:

? 純化的 DNA 中有乙醇殘留:在洗滌步驟中可能會帶來乙醇的殘留。加入洗脫液之前將離心柱在最大轉速下離心 2-3 分鐘徹底干燥離心柱。

? 純化的 DNA 中有鹽分殘留:采用正確的洗滌操作步驟,用不同 CB 溶液洗滌后再用 WB 洗滌。


克隆常見問題解答

Q:如何選擇合適的克隆載體?

A:Taq系列酶擴增的片段,選用T載體;Pfu系列酶擴增片段,選用Blunt系列載體,也可以加“A”后和T載體連接,但效果不如直接連接Blunt系列載體。如果PCR模板是質粒DNA,推薦使用雙抗性載體。


Q:插入片段的量多少合適?

A:

? 片段加入量可根據片段長度不同進行調整。 最佳插入片段DNA量:載體與片段摩爾比=1:7

? 可以粗略的按照“1 kb 20 ng”的比例計算。(如1 kb加20 ng,1.5 kb加30 ng等)、(在膠上通過TransGen的DNA 分子量標準粗定量即可)

? 片段加入量最大為4μl,即使片段濃度很低也不要超過此限。片段加入量最少為0.5μl,可以補充無菌水以方便操作。

? 反應溫度范圍:20-37℃,最適反應溫度為25℃。


Q:反應時間多長合適?

A:

? 大多數1 kb以內的PCR產物室溫反應5分鐘即可完成反應。以下幾種情況可以延長反應時間以獲得更理想的效果:

? 具有特殊結構(高AT/高GC/反向重復序列)的片段:10-20分鐘。

? 膠回收片段或加"A"片段:10-15分鐘(該條件適用于3 kb以內的片段)。

? 大于3 kb的PCR產物需延長至15-20分鐘。


Q:連接產物可以保存多久?

A:連接產物可以置于-20℃或2-8℃冰箱,一周內使用。


Q:多克隆位點上的酶切位點切不開?

A:篩選到的克隆來源于模板質粒而不是連接產物。推薦使用雙抗載體,篩選時使用模板質粒不具有的抗性。


Q:克隆數少或陽性率低?

A:

? 影響克隆數目和克隆效率的因素有許多,如感受態細胞效率、插入片段質量、基因結構、插入片段長度、插入片段和載體的比例等。如發現克隆數少或克隆效率低,可嘗試下列方法:

? 感受態細胞的轉化效率對克隆數有重要影響,轉化效率高低與連接產物克隆數的多少不呈線性關系。假設細胞轉化效率為1×109 cfu/μg DNA時,克隆數為1000;轉化效率為1×108 cfu/μg DNA時,克隆數并不是100,而是低于100。為保證克隆數,請選用高轉化效率的Trans1-T1感受態細胞。

? 使用新鮮的PCR產物:PCR產物于2-8℃保存,1-2天內使用。對于膠回收產物,應盡量縮短紫外照射時間并適當延長反應時間 (10-15分鐘)。

? 目的片段濃度極低時,進行濃縮,以保證反應時分子碰撞機率。

? 毒基因:使用Trans10感受態細胞。

? 具有特殊結構 (高AT/高GC/反向重復序列) 的基因:適當延長反應時間至10-20分鐘。


Q:PCR鑒定重組子失敗?

A:當用通用引物鑒定重組子,沒有得到目的擴增產物,又沒有載體自連帶,說明PCR失敗。重新優化PCR條件或提取質粒,以質粒作模板擴增或酶切鑒定包含重組子的克隆。


Q:重組克隆呈現淡藍色或“Fish eye”?

A:插入片段沒有影響LacZ基因讀碼框,或插入片段太短 ,這種情況下克隆呈現淡藍色或“Fish eye”,可正常鑒定。


DNA Marker使用常見問題解答

Q:電泳條帶模糊?

A

? 電泳緩沖液緩沖能力差。 電泳緩沖液多次使用后,離子強度降低,pH值上升,緩沖性能下降,可使DNA電泳產生條帶模糊和不規則的DNA條帶遷移的現象。

? 電壓過高,電泳時間過長。電泳時電壓不應該超過20 V/cm,電泳溫度應該低于30℃。如果電泳時電壓和溫度過高,可能導致出現條帶模糊和不規則的DNA條帶遷移的現象。特別是電壓太高易出現缺帶現象。電泳過程中由于會產熱,因此電泳時間長容易發生條帶模糊,特別是小片段會變得模糊。

? 凝膠放置時間太長或瓊脂糖的質量差,導致DNA 條帶分辨率降低。


QDNA Marker 降解?

A:污染了核酸外切酶。建議用滅菌的槍頭,用后及時將管蓋擰緊。點樣時勿將電泳緩沖液帶入管中,建議更換槍頭。


Q:用EB瓊脂糖膠電泳不同時間會出現條帶亮度變化?

A:由于電泳過程中條帶與EB泳動方向相反,結合EB的量會隨時間變化,因此電泳后條帶亮度會發生變化。因此建議使用EB染膠實現精準定量。


QDNA Marker泳條帶分離效果不好?

A:瓊脂糖制膠濃度不合適,導致分辨率降低。制膠不均勻有時也會導致電泳異常。建議使用新制備的凝膠,制膠時注意操作中帶來的濃度誤差。一般對于大分子量片段,低濃度膠分離效果好;對于小分子量片段,高濃度膠分離效果好。


Q:不同核酸染料對DNA Marker 遷移率的影響?

A:預加GeneFinder、GelStain、GoldView到DNA Marker中,對Marker的遷移率都有一定的影響。


限制性內切酶常見問題解答

Q:不酶切或酶切不完全

A:

? 酶失活或濃度過低:用已知含目的酶切位點的對照 DNA 測試該酶活性;酶應貯存于 -20℃,-70℃時會凍結;避免反復凍融降低酶活;可根據實驗要求適當加大酶

量。

? DNA 濃度不合適:推薦 50 μl 反應體系酶切 1-2 μg DNA;DNA 過量時可適當增加酶量。

? DNA 被抑制劑污染:與對照 DNA 樣品一起酶切,驗證其是否被抑制;重新純化 DNA 樣品。

? DNA 可能形成超螺旋:不同酶對超螺旋結構 DNA 消化效率不一樣,可適當加大酶量。

? 識別位點過于接近 DNA 末端:一般在識別位點兩端各加 6 個保護堿基可確保酶切效率。

? 識別位點不存在:驗證 DNA 序列。

? 反應條件非最優化:緩沖液使用不當;按比例使用新鮮緩沖液重復實驗;按照推薦方案進行雙酶切或分步酶切。

? 甲基化封閉酶切位點:PCR 產物未甲基化;使用 dam-/dcm-菌株轉化。


Q:出現非預期帶型

A:

? 確定正確帶型:酶切產物與對照 DNA 樣品一起電泳,確定是未消化完的底物條帶或者是星號活性產生的非預期條帶。

? DNA 樣品污染:重新制備或純化樣品

? 含其它酶切位點:驗證 DNA 序列


Q:DNA 電泳呈彌散帶

A:

? 酶與 DNA 結合緊密未完全解離:使用隨酶提供的 DNA Loading Buffer 上樣電泳;或另加入終濃度為0.05-0.2% 的 SDS。

? 核酸酶污染:制備新的底物樣品;使用新的緩沖液和水。

? 電泳條件不合適:使用新鮮的電泳緩沖液和凝膠;合適的電流電壓避免過熱。


Q:星號活性 (特異性降低或改變)

A:

? 高甘油濃度 (>5% v/v):酶儲存液含 50% 甘油;因此酶量不超過反應體積的10%。選擇 50 μl的標準反應體系,以減少反應過程中水的蒸發而提高甘油濃度。

? 非最適緩沖液:盡可能使用推薦緩沖液,離子濃度和 pH 的改變會引起星號活性。

? 存在有機溶劑 ( 如 DMSO、乙醇、DMF 等):確保樣品在制備過程中不含任何有機物,如 DNA 制備過程中可能混入的乙醇。

? 混有其它二價離子 (如 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+) 去除樣品中二價離子


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