產品FAQ

qPCR常見問題解答

Q:Passive Reference Dye的作用是什么,如何使用?

A:它們是針對不同機器型號校正加樣管間誤差的參比熒光染料。它們的濃度為50×,使用時在20μl體系中加入0.4μl即可。

Q:CT值出現過晚?

A:可能是擴增效率低,反應條件不夠優化。此外PCR各種反應成分的降解或者PCR產物太長 (一般采用80-250 bp的產物長度) 也會造成CT值出現過晚。

Q:qPCR SuperMix是否需要調整Mg2+濃度?

A:一般不需要調整,當PCR結果不理想或通過其它調整不能獲得明顯改善時,可以考慮通過調整Mg2+濃度以改進擴增結果。

Q:擴增曲線異常?

A:

? 基線設置有誤。

? 高濃度的模板會導致CT值過早出現,即基線范圍變小,導致機器讀取熒光數值有誤。

Q:重復性差?

A:

? 操作誤差。

? 模板濃度過低會導致重復性變差,可適當提高模板濃度,降低稀釋倍數。

? 機器本身的孔間溫度不一致。

Q:NTC不為零,如何優化?

A:

? 提高退火溫度。

? 降低引物工作濃度,如需要可降至60 nM。

? 盡量在冰上操作。

? 重新設計引物,必要時可設計多對引物,優中選優。



RT-PCR常見問題解答

Q:RNase H活性對反轉錄反應的影響?

A:RNase H活性能夠催化降解DNA/RNA 雜交體中的RNA。RNase H活性缺失避免了第一鏈cDNA 合成反應中DNA/RNA 雜交體中模板RNA被降解,從而保證第一鏈cDNA 的合成量和長度。


Q:不同溫度下的反轉錄反應有何差別?

A:一般的反轉錄酶的適宜反應溫度是42℃,但是對于某些GC含量高的基因或二級結構復雜的基因,在42℃不足以打開二級結構,使cDNA合成無法順利進行。此時需要用耐高溫的反轉錄酶,如TransScript ? II RT或TransScript ?-Uni RT,在高溫 (≤55℃或≤65℃)條件下進行反轉錄以獲得較好的結果。


Q:RT-PCR后,無PCR產物的原因?

A:在反轉錄反應前一定要電泳驗證RNA的完整性,確認RNA沒有降解。RNA不要保存時間過長,盡快進行反轉錄及PCR操作。


Q:基因克隆測序后經常發生突變的原因?

A:從cDNA進行基因克隆時,突變有可能發生在反轉錄過程,也可能發生在PCR過程中。一般用保真性高的Taq酶或者Pfu酶進行擴增,循環數不要太高;可通過減少模板量、減少循環數降低突變機率。為保證反轉錄時的保真性,請選擇保真性高的反轉錄酶。


Q:RT-PCR時模板一般使用多少?

A:反轉錄反應體系為20μl時,用50 ng-5μg /5-500 ng Total RNA/mRNA進行反轉錄,RT-PCR用1/20-1/10 PCR體積 (2.5-5μl) 的反轉錄產物作為PCR模板 (50μl反應體系)


PCR常見問題解答

Q: 擴增效率低:條帶較弱或無擴增

A:

? 酶的原因:實驗表明,PCR酶對于DNA具有一定的偏好性。如使用一種酶經過優化難以獲得理想擴增時,可以嘗試其它PCR酶。

? 模板引物的原因:確保模板、引物的品質,保證沒有降解。另外,如果模板含有較多的抑制物時(如植物基因組模板),推薦使用抗抑制能力強的PCR酶;還可以對模板進行梯度稀釋后擴增,摸索合適的模板用量。

? 反應體系與條件的原因:增加循環數、降低退火溫濕度、適當提高Mg2+工作濃度,都可以提高擴增效率,但同時會導致特異性與保真性下降,需要根據具體的實驗要求優化合適的條件。


Q: 擴增特異性差:引物二聚體、雜帶、拖尾等

A:

? 選擇熱啟動酶:與普通PCR酶相比,熱啟動酶具有更高的擴增效率和特異性。

? 優化反應體系與條件:升高退火溫度可以有效提高特異性。另外減少循環數、適當降低Mg2+工作濃度,也可以提高特異性,但都會導致擴增效率的下降,需要根據具體的實驗要求優化合適的條件。還可以嘗試某些特殊的程序,如巢式PCR、Touch          Down PCR等。

? PCR產物需要進行后續實驗時,如果確定有目的條帶擴增,可以凝膠回收目的條帶。


Q:擴增保真性差:突變、插入、缺失等

A:

? 選擇高保真酶:B型DNA聚合酶,如Pfu系列酶,具有3’-5’的外切酶活性,能夠校正錯配的堿基,具有高保真性。另外,復合酶中由于有B型DNA聚合酶的存在,也具有較高的保真性,但保真性比B型DNA聚合酶要低。

? 優化PCR體系與條件:適當增加模板量、減少循環數,可以降低突變機率,提高保真性。

確認保真性低的原因:有時保真性低并非由PCR引起,PCR通常只會導致數量很少的單堿基突變。如果產物測序后,發現大量的突變,或有明顯的插入、缺失等,很可能是來自其它實驗步驟,如DNA在大腸桿菌中復制是發生重組,或是測序時的污染。這種情況,可以重新反轉錄或選保真性更高的反轉錄酶。


Q:Pfu酶擴增如何加“A”?

A:

? 在10 μl體系中,加入純化后PCR產物、0.2 μl Taq DNA Polymerase、0.5 μl 10 mM dNTP (或0.5 μl 2.5 mM dATP)、1 μl 10xTaq Buffer, 72℃ 反應10-15分鐘即可。


Q:出現假陽性擴增

A:

? 引物設計不合適:選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,因而在進行PCR擴增時,擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現假陽性。需重新設計引物。

? 靶序列或擴增產物的交叉污染:一是整個基因組或大片段的交叉污染,導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外,所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時,在加標本前,反應管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,與引物互補后,可擴增出PCR產物,而導致假陽性的產生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。




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